Módszer tejalvasztó enzimkészítmények proteolitikus aktivitásának meghatározására
1. Zwecks Vermeidung der bei Vergleichung der proteolytischen Enzymkonzentration von grössenordentlich verschiedenen proteolytisch aktiven Enzympräparaten entstehenden Schwierigkeiten (eventuelles Fehlen der Substrat Gesättigtheit, Verminderung der Reaktionsgeschwindigkeit während der Messung), habe...
Elmentve itt :
| Szerzők: | |
|---|---|
| Dokumentumtípus: | Cikk |
| Megjelent: |
Lapkiadó Vállalat
Budapest
1972
|
| Sorozat: | Élelmiszervizsgálati közlemények
|
| Kulcsszavak: | Élelmiszervizsgálat - analitikai kémia - módszer, Élelmiszerkémia - módszer |
| Tárgyszavak: | |
| Online Access: | http://acta.bibl.u-szeged.hu/81436 |
| Tartalmi kivonat: | 1. Zwecks Vermeidung der bei Vergleichung der proteolytischen Enzymkonzentration von grössenordentlich verschiedenen proteolytisch aktiven Enzympräparaten entstehenden Schwierigkeiten (eventuelles Fehlen der Substrat Gesättigtheit, Verminderung der Reaktionsgeschwindigkeit während der Messung), haben Verfasser ihre bisher angewandte Methode für Aktivitätsmessung überprüft. Als Modell-Enzym zu den Versuchen benützten wir das von der Chinoin-Fabrik hergestellte, Вас. subtilis entstammende neutrale ProteinPräparat. 2. Unter den Versuchsbedingungen wmr der Zusammenhang der Menge von gespaltenem Casein-Enzymkoncentration nicht linear (Abb. l/а), die Menge des gespaltenen Caseins war der Quadratwurze der Enzymkoncentration proportioneil (Abb. 1/b). 3. Im Falle einer der Aktivitätseinheit entsprechenden Enzymmenge und 15— 105 Minuten Reaktionsteit ist die Aktivität der Quadratwurzel der Rekations zeit proportioned (Abb. 2/a, 2/b) . Daher kann die Reaktionsgeschwindigkeit durch Extrapolierung nicht festgestellt werden, sondern aufgrund des Richtungstangenten desjenigen Tangenten, welcher im zur Messungszeit (1 Std) gehörendem Punkte der Funktion Aktivität-Reaktionszeit zu der Kurve gezogen wurde. Die im gegebenen Falle auf diese Weise bestimmte Reaktionsgeschwindigkeit ist 6,5-mal geringer, als der aufgrund des im 0 Punkt zur Kurve gezogenen Tangenten berechnete Wert. 4. Die graphische Methode von SELWYN, wie auch der Zusammenhang zwischen Substratkonzentration und Aktivität weisen darauf hin, dass unter ihren Messungsbedingungen das Substrat gesättigt war (Abb. 3, Abb. 4). 5. Aufgrund der Resultate wurde die Reaktionszeit und die Enzymmenge gleicherweise verringert: mit einer im Vergleich zur Ursprünglichen etwa auf 1 /3 reduzierten Enzymeinwaage (0,005 mg/7,5 ml) erhielten sie im 0 -3 0 Minuten Reaktionsbereich in sehr guter Annäherung (r = 0,9899) einen linearen Zusammenhang zwischen der Menge des gespaltenen Caseins und der Reaktionszeit (Abb. 5). Auf diese Weise wird die Bestimmung der Enzymaktivität aus experimentell bestimmten Werten der Anfangsgeschwindigkeiten ermöglicht. 6. Im Substratkonzentrationsbereich 0,66 — 4,00 mg/ml kann der Zusammenhang zwischen der Menge des gespaltenen Caseins und der Reaktionszeit mit einer gemeinseman Geraden beschrieben werden. Auch dies bestätigt das Vorhandensein der Gesättigtheit des Substrates. 7. Aufgrund ihrer Ergebnisse modifizierten die Verfasser ihr zur Aktivitätsmessung dienendes Gerät. Die Substratkonzentration (1,3 mg/ml) wurde nicht geändert, die Enzymeinwaage aber auf etwa 1/3 und die Reaktionszeit auf 20 Minuten reduziert. Die Aktivität des Modell-Enzyms betrug mit der neuen Methode gemessen 7,41 • 10-4 IE und die Enzymkonzentration 148,2 IE/g. 1. The method applied up to the present for the determination of proteolytactivity was examined in order to eliminate the difficulties (such as the lack of substrate saturation, the decrease of the reaction rate during the measurement) occurring at the comparison of the concentration of proteolytic enzyme in enzyme preparations for milk clotting possessing proteolytic activities differing from each other by several orders of magnitude. A neutral protease preparation produced by the factory Chinoin from Вас. subtilis served as a model enzyme in the present investigations. 2. Under the conditions of measurement the correlation between the amount of decomposed casein and the enzyme concentration was not linear (Fig. 1/a) while the amount of decomposed casein proved to be proportional to the square root of the enzyme concentration (Fig. 1/b). 3. On applying an enzyme quantity of unit activity for reaction periods between 15 and 105 minutes, the activity was proportional to the square root of the reaction period (Fig 2/a and 2/b). Thus, the reaction rate could not be determined by extrapolation but rather on the basis of the directional tangent of the curve drawn at the point of the function activity vs. reaction rate pertaining to the actual measurement period (1 hour). In the given case, the reaction rate established in this way was lower by 6.5 than the value calculated on the basis of the tangent of the curve drawn at point 0. 4. Both the graphic method of Selwyn and the correlation substrate concentration vs. activity proved that substrate saturation actually existed under the conditions of measurement applied in the present experiments (Figs. 3 and 4). 5. As the experimental results show, both the reaction periods and the amounts of weighed enzyme were reduced. On weighing an enzyme amount of about one third of the original dose (0.005 mg/7.5 ml) and applying reaction periods from 0 to 30 minutes, the correlation observed between the amount of decomposed casein and the reaction period proved to be linear at an excellent approximation (r = 0.9899) (Fig. 5). In this way it is possible to determine enzyme activity from the initial values of the reaction rate measured experimentally. 6. In the domain of substrate concentration 0.66 — 4.00 mg/ml, the correlation between the amount of decomposed casein and the reaction period can be described by the same straight. This proves also the existence of substrate saturation (Fig. 5). 7. On the basis of the obtained results, certain modifications were carried out in the evolved instrument for the measurement of activity. The applied substrate concentration was unchanged (1.33 mg/ml) whereas the amount of weighed enzyme was decreased to about one third, and the reaction period to 20 minutes. On using this novel procedure, the activity of the model enzyme was found to be 7.41 x l0 ~ 4 international units, and its enzyme concentration 148.2 international units/g. 1. Les auteurs ont sounds ä un examen la méthode adoptée dans Ieur laboratoirc, afin d’éviter les difficulties qui se produisent lors de la comparaison des activités protéolytiques de différentes preparations coagulant le Iáit. Puisque ces valeurs peuvent étre différentes de plusieurs ordres de grandeur, il fant, chez les preparations ä activité élevée, compter avec Pépuisement du Substrat, ce qui améne ä line diminution incontrólable de la reaction au cours du dosage. Dans les experiences on s’est servi, en tant qu’enzyme modele, de la preparation de protéase neutre d’origine Вас. subtilis, produit de l’usine pharmaceutique «Chinoin», Budapest. 2. Dans les conditions du dosage la correlation elitre la quantité de la caséine décomposée et la concentration enzymatique n’était pás linéaire (Fig l/а), par contre, la quantité de la caséine décomposée se montrait proportionnelle á la racine carrée de la concentration enzymatique (Fig. 1jb). 3. En employant la quantité d’enzyme qui correspond ä l’unité de I’activité et des temps de réaction entre 15 et 105 min., l’activité se montre proportionnelle á la racine carrée de l’activité ( Figs. 2/a et 2/b). C’est pourquoi lavitesse de la réaction ne se fait pás établir par extrapolation. 11 faut la caluler, par contre, ä partir de la pente de la tangente á la courbe de la fonction activité - temps de réaction, dans le point qui correspond au temps du mesurage (1 heure). La vitesse de la réaction ainsi déterminée est, dans le cas donné, 6,5 fois plus faible que la valeur calculée ä partir de la tangente dans le point 0. 4. La méthode graphique de Selvvyn, ainsi que la rapport entre la concentration du Substrat et l’activité ont également prouvé que, dans les conditions du mesurage, la saturation du substrat a subsisté (Figs. 3et4). 5. A la base des résultats on a diminué et la durée de la réaction et la quantité d’enzyme employée: en réduisant la concentration de l’enzyme á environ 1/3 de la valeur originale (c’est-á-dire á 0,005 mg dans 7,5 ml), on a obtenu, dans l’intervalle de 0 ä 30 minutes de durée de la réaction, une corrélation linéaire entre la quantité de la caséine décomposée et la durée de la réaction ( Fig. 5). L’approximation de la corrélation était trés bonne (r = 0,9899). Ainsi il devien possible ci’établir l’activité enzymatique á partir des valeurs initiales de la vitesse de réaction, mesurées par voie expérimentale. 6. Dans l’intervalle de concentration du substrat entre 0,66 et 4,00 mg/ml, la corrélation entre la quantité de la caséine décomposée et la durée de la réaction se fait décrire par une droite commune, ce qui prouve également la substistance de la saturation du substrat lors du dosage ( Fig. 5). 7. A partir des résultats, on a modifié la méthode du dosage de 1 ’activité. En maintenant la concentration du substrat (1,33 mg/ml) inchangée, on a réduit la concentration de l’enzyme á environ un tiers et la durée de la réaction á 20 minutes. L’activité de l’enzyme modéle, déterminée selon la méthode modifiée, correspond ä 7,41-IO“4 UI (unités internationales), tandis que la concentration enzymatique de la préparation constitue 148,2 Ul/g. |
|---|---|
| Terjedelem/Fizikai jellemzők: | 31-43 |